DNA突變是癌症診斷的重要生物標誌物👩🏼‍💻，在癌症的早期識別和轉移監測中發揮著關鍵作用，尤其是低頻突變。在FDA批準的突變檢測試劑中，124種被指定用於組織活檢👩🏻‍🦽，47種用於液體活檢，組織樣本仍然是檢測DNA突變的主要依據🛌。但由於腫瘤異質性高，對於低變異等位基因頻率(VAF)的樣品，需要檢測靈敏度高的方法來避免假陰性結果。另一方面，人類基因組中存在3.1%的突變熱點和0.2%的熱點簇，如KRAS(外顯子2~4)和TP53(外顯子5~8)、EGFR和BRAF基因。這些熱點和熱點簇與癌症的發生、進展和患者生存有關。例如，BRAF基因突變熱點簇的患者生存率較高，而TP53和EGFR基突變熱點的患者生存率較差🧚🏽‍♀️。因此，開發能夠檢測熱點區域低頻突變的方法至關重要🫱🏿。

為此，意昂4体育平台宋萍課題組開發了基於核酸雜交熱力學能調控的Long Blocker Displacement Amplification技術發表在Angewandte Chemie International Edition（https://doi.org/10.1002/anie.202400551）

研究者構建了一種長抑製探針置換擴增技術(Long Blocker Displacement Amplification, LBDA)實現了針對組織樣本中腫瘤熱點突變的高靈敏、高通量檢測。該技術基於核酸雜交熱力學能的精準調控🧑🏼‍🌾，利用正向引物和抑製探針之間的鏈置換反應👱🏼‍♀️，並探究了影響雜交熱力學能的因素包括溫度➗、鹽濃度等，實現對突變位點放大檢測區間較常規抑製探針擴增技術高2倍🙆🏽‍♂️，從而獲得了可以實現單重探針單管同時檢測81個不同的核酸突變，檢測限最低可以達到0.01%。

圖1 LBDA的設計原理及常規方法對比

團隊首先探索了針對特定核苷酸設計的單個Long Blocker的抑製能力及其對各種突變類型的富集能力。將rs10508599 (T)的合成DNA模板定義為野生型模板（WT）🐉，將三種類型的突變(G、C🏍、A)定義為突變型模板（MT），並根據WT序列設計長阻斷劑。

根據實驗結果，LBDA可以在一次反應中檢測到低至0.5%變異等位基因頻率(VAF)的不同突變類型🙆🏽‍♀️，與野生型相比，21個突變DNA模板的中位富集倍數為1000倍🧏🏽‍♂️🤖。LBDA能夠在富集區富集所有與WT序列不同的變異。

圖2 LBDA在不同突變中的驗證

根據國際癌症研究機構(IRAC)的報告，結直腸癌是全球第三大流行癌症🕰，也是導致癌症相關死亡的第二大原因。KRAS和NRAS突變在結直腸癌中很常見，經常發生在突變熱點。

圖3 LBDA在KRAS🦸🏻‍♀️、NRAS的合成模板中測試結果

因此研究者利用LBDA-qPCR檢測KRAS和NRAS突變熱點✍🏻，利用單條Long Blocker能夠覆蓋81個突變類型（數據參考COSMIC），在合成模板和結直腸癌組織樣本中分別進行了測試🔋。此外，通過Sanger測序驗證突變類型，與下一代測序結果一致☠️🎅🏽。

圖4 LBDA在臨床樣本中測試結果

本研究中LBDA-qPCR方法是檢測癌症中低頻突變的一種有效而靈敏的工具，特別是可以富集突變熱點簇的區域🧑🏼‍🔬🧑🏻‍🦰。實驗中單個Long Blocker可以富集高達44 nt的各種突變類型🤰🏼🚵🏻‍♂️，同時僅用20 ng DNA輸入即可實現10,000倍的突變富集。研究者設計用於檢測KRAS和NRAS突變的LBDA-qPCR🙎🏼‍♀️。在臨床樣本中測試的結果揭示了結直腸癌組織中腫瘤的異質性🐧，以及組織與血液樣本之間的異質性。總之🙅🏿，LBDA-qPCR具有高通用性和高靈敏度，是一種全面、靈敏地檢測癌症遺傳變異的實用方法。