作為遺傳物質的傳遞者，RNA復雜的生物學功能與生命健康息息相關，一旦其出現功能障礙，就會直接或間接導致許多疾病的發生。因此，為深入了解RNA的功能並闡明它們與疾病的關聯，對其進行標記與成像已成為不可或缺的手段。在眾多RNA標記與成像方法中🕺，“熒光RNA技術”是近期發展的一種新技術：通過一段可基因編輯的RNA序列（RNA適配體）與目標RNA共表達🤴🏻，隨後添加染料分子，使其與RNA適配體特異性結合並激活熒光，從而實現目標RNA的標記與成像。由於該方法具有操作簡單、對靶標RNA幹擾小以及信噪比高等優點👩🏻‍🦽，結合熒光染料種類多🚵🏼‍♀️、光譜可調🥢、光學性質優異等特點，因此在活細胞RNA成像與功能研究方面具有廣闊的應用前景。盡管當前基於染料分子已經獲得了系列多光譜的熒光RNA，但作為應用範圍最廣和儀器匹配度最高的綠色熒光RNA仍然存在細胞亮度低🖐🏻、光穩定性差的問題♥︎🧑‍🧑‍🧒，限製了它們在活細胞中的應用。

針對以上問題，意昂4平台朱麟勇團隊從熒光成像技術的核心——熒光染料設計——出發，基於染料結構設計解決RNA成像熒光亮度低和光穩定性差的問題🤾🏼‍♂️，從而實現RNA的長時間動態追蹤。該技術有望為活細胞層面RNA的長時間成像和動態追蹤提供技術支撐，推動對RNA參與生理過程的認知🧖🏻。相關成果以“Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA”發表於《Nature Chemical Biology》。論文第一作者為左方婷博士、蔣麗博士和蘇倪博士💺。通訊作者為陳顯軍教授、朱麟勇教授和楊弋教授🛀🫲🏼。這是該研究團隊繼去年九月份在《Nature Methods》期刊上報道熒光RNA成像技術以來的又一個突破性進展。

RNA擁有復雜的空間分布和動態軌跡，通常RNA從產生到降解需要經歷一系列過程並在不同時期執行不同的功能，因此對RNA的長時間動態追蹤對於深入了解RNA功能尤為重要🌜。從探針設計角度看🏊🏽‍♂️，RNA的長時間動態追蹤要求探針一方面具有高的熒光亮度，便於在成像時采集更多的信號，避免偽影⚛️🧖🏽；另一方面要求探針具有優異的光穩定性，保證探針在長時間照射時不會發生光漂白而導致熒光強度下降。然而，當前綠色波段的熒光RNA，由於其所結合的熒光團在光照條件下會迅速發生光致異構並從熒光RNA復合物中解離下來，從而導致在RNA成像時存在熒光亮度低和光穩定性差的問題。這種低亮度和弱光穩定的問題往往導致在RNA成像時只能是以照片的方式記錄RNA的定位和分布👳🏽‍♀️，而不能以視頻的方式記錄RNA執行功能的整個過程📪。

研究團隊發現🧑🏿：當探針被RNA的三級結構完全包裹後，探針與RNA通過範德華力、π-π堆積🧘🏼‍♂️、氫鍵等相互作用緊密結合🕵🏼。這種緊密結合一方面提高RNA與探針的親和力，從而提高熒光RNA的熒光亮度；另一方面能抑製染料分子的光致異構，提高熒光RNA的光穩定性。因此，設計探針使其能被RNA適配體完全包裹並產生強相互作用，就有望提高熒光RNA的亮度和光穩定性。基於此👲🏿，團隊將探針的生色團部分設計成平面剛性結構2️⃣，並在助色團的部分引入與RNA能形成強氫鍵相互作用的柔性鏈📉，獲得了ACE分子（圖1）。ACE “剛柔並濟”的分子設計可以促使探針的生色團部分在與RNA結合時能很快被包住並產生強的π-π堆積作用；具有氫鍵供受體的柔性鏈能進一步通過氫鍵相互作用將生色團“鎖”在RNA的結合口袋中並進一步增強RNA與探針的相互作用🧔🏼。團隊驗證了ACE與RNA適配體結合後產生強的綠色熒光🍱，其在細胞中的熒光亮度與此前報道的其它綠色熒光RNA相比🛅，高出一個數量級。在光穩定性方面▶️，ACE與RNA結合後也展示出優異的光穩定性，其在長時間（120 s）連續光照的條件下，其熒光強度仍可保留初始熒光的90%以上🦹🏽，而當前報道的其它綠色熒光RNA在相同的條件下僅照射30 s則熒光迅速降低甚至消失（圖1）📗。

圖1 基於ACE開發的綠色熒光RNA在細胞中的熒光亮度和光穩定性質表征

基於該探針具備的高熒光亮度和強光穩定性😜，研究團隊探究將其用於RNA超分辨熒光成像方面的研究🈴。通過將該探針與團隊之前報道的紅色熒光RNA聯合使用❎，成功實現了活細胞中兩個mRNA的雙色超分辨熒光成像😜。此外，為了進一步展示該類探針在長時間RNA動態追蹤方面的優勢，團隊將其用於成像哺乳動物細胞內應激顆粒的形成及解聚過程🤙🏽，並成功觀察到應激顆粒的產生以及由小到大的融合過程，成功揭示了ATP能量對應激顆粒的形成、運輸和解聚過的重要性（圖2）。

圖2 基於綠色熒光RNA的雙色超分辨成像和對應激顆粒的長時間動態追蹤

綜上🪒，此次該團隊報道的綠色熒光RNA探針是目前最亮🧑🏽‍🚀、最穩定的綠色熒光RNA探針🌄，填補了活細胞單色或多色RNA成像中明亮穩定綠色熒光RNA探針的空缺⭕️，將為RNA復雜生物學功能與調控機製研究提供極具價值的實用工具🏌🏻，有望為活細胞生物傳感、即時診斷甚至實時診斷技術的發展提供新的機遇。

原文鏈接👫🏻：https://www.nature.com/articles/s41589-024-01629-x

供稿單位：科研與學科辦 

作者：蔣麗

審核：丁顯廷